BMC Medicine Band 20, Artikelnummer: 481 (2022) Diesen Artikel zitierenInhaliertes NO ist ein selektiver pulmonaler Vasodilatator, der sich als therapeutisch für Patienten mit pulmonalarterieller Hypertonie (PAH) erwiesen hat.Das am weitesten verbreitete NO-Verabreichungssystem in der klinischen Praxis basiert auf Zylindern, ist jedoch leider durch seine hohen Kosten, die komplizierte Verabreichung und die Anforderung einer umfangreichen Lieferkette begrenzt, wodurch weltweit ein großer medizinischer Bedarf besteht.Um den Bedarf an einer schnellen, erschwinglichen und sicheren Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) für die Inhalationstherapie zu Hause bei Patienten mit PAH zu decken.Wir haben ein neuartiges tragbares Gerät entwickelt, um NO aus einer Nitritkomplexlösung mit einem Kupfer(II)-Liganden-Katalysator abzuleiten, und seine Wirksamkeit in einem Schweinemodell von PAH weiter untersucht.Dieses Modell wurde unter Verwendung von weiblichem Bama-Miniaturschwein erstellt und durch Verabreichung von Monocrotalin (MCT) induziert.Dieser Generator könnte schnell und sicher therapeutisches NO in Konzentrationen von 0 bis 100 Teilen pro Million (ppm) mit dem am wenigsten disproportionierten Stickstoffdioxid (NO2) und Nebenprodukten erzeugen.Es könnte den pulmonalarteriellen Druck (PAP) und den pulmonalvaskulären Widerstand (PVR) bei Ferkeln mit PAH wirksam verringern, ohne größere physiologische Störungen zu verursachen.Unser elektrochemischer NO-Generator ist in der Lage, die gewünschten NO-Dosen für die pulmonale Vasodilatation auf sichere und nachhaltige Weise zu niedrigen Kosten zu produzieren, was den Weg für nachfolgende klinische Studien bei Patienten mit PAH und anderen häufigen kardiopulmonalen Erkrankungen mit hoher Krankheitslast ebnet um die Welt.Die pulmonalarterielle Hypertonie (PAH) ist ein schweres klinisches Syndrom, das durch eine fortschreitende pulmonalarterielle Remodellierung und einen erhöhten pulmonalarteriellen Druck (PAP) gekennzeichnet ist [1].Trotz der Entwicklung neuartiger medizinischer Therapien bleibt die Langzeitprognose von Patienten mit PAH alles andere als zufriedenstellend, insbesondere bei Säuglingen mit idiopathischer PAH und Erwachsenen mit hartnäckiger PAH [2, 3].Eine schlechte Kontrolle von PAP ist ein Hauptrisikofaktor für einen frühen Tod bei PAH-Patienten.Aus verschiedenen Gründen haben viele Patienten mit PAH eine suboptimale Kontrolle von PAP.Für diese PAH-Patienten besteht ein dringender Bedarf an zuverlässigen und nachhaltigen Therapien zur häuslichen Behandlung des Lungendrucks.Die aktuellen Medikamente der ersten Wahl für PAH sind vasoaktive Wirkstoffe wie Sildenafil, Nitroprussid und Bosentan [1], aber die Anwendung dieser Medikamente ist mit einer systemischen Vasodilatation verbunden, die zu einer langfristigen arteriellen Hypotonie führen kann.Seit den frühen 1990er Jahren hat sich gasförmiges Stickstoffmonoxid (NO) als der erste verifizierte selektive Vasodilatator herausgestellt, der auf die Lungengefäße abzielt, um eine starke gefäßerweiternde Wirkung auszuüben.NO wird im Allgemeinen von Endothelzellen freigesetzt und erhöht die Spiegel von zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP) durch Aktivierung des Proteinkinase G (PKG)-Signalwegs, wodurch die glatten Muskelzellen der Lungengefäße entspannt werden, ohne eine systemische Hypotonie zu verursachen [4, 5].1999 wurde inhaliertes NO von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) für die Behandlung von persistierender pulmonaler Hypertonie bei Neugeborenen (PPHN) zugelassen [6].Jüngste Studien haben gezeigt, dass inhaliertes NO auch bei Patienten mit Ischämie-Reperfusionsverletzung [7, 8], chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) [9], Einlage eines linksventrikulären Unterstützungssystems [10] und intravaskulärer Hämolyse [11] angewendet werden könnte ] und angeborenen Herzfehlern [12] sowie in der COVID-19-Atemtherapie [13].Gegenwärtig werden zylinderbasierte NO-Abgabesysteme aufgrund ihrer Zuverlässigkeit und Sicherheit von der medizinischen Gemeinschaft weit verbreitet verwendet [14].Die Verwendung von NO-Gasflaschen ist jedoch aufgrund ihrer Sperrigkeit und Abhängigkeit von spezialisiertem Personal und einem komplizierten Versorgungsnetz auf wenige stationäre klinische Einrichtungen beschränkt, was zu sehr hohen medizinischen Kosten führt [15].Obwohl eine Art 0,16-l-Miniatur-NO-Zylinder, INOpulse, im ambulanten klinischen Szenario getestet wurde [16], ist sie aufgrund ihrer begrenzten NO-Speicherkapazität noch weit davon entfernt, in der Heimtherapie eingesetzt zu werden.Tatsächlich kann die fünftägige Behandlung von PPHN-Patienten mit zylinderbasiertem NO durchschnittlich 14.000 US-Dollar kosten [14].Daher sind NO-Zylinder nicht für Bedingungen geeignet, die eine langfristige Behandlung von PAH erfordern, und sind in Ländern mit begrenzten Ressourcen weitaus weniger zugänglich.Als Alternative zu NO-Zylindern haben sich in den letzten Jahren NO-Generatoren herauskristallisiert, beispielsweise Generatoren, die auf Impulsentladung oder NO2-Reduktion basieren [17].NO-Generatoren, die auf Impulsentladung beruhen, sind jedoch aufgrund kritischer Mängel wie unzureichender NO-Produktion und unvermeidlicher toxischer Nebenprodukte, einschließlich NO2/O3/Messingmetallpartikeln, nicht über das vorklinische Stadium hinausgekommen.Darüber hinaus wirft die Nachfrage nach Hochspannungsentladung Sicherheitsbedenken auf, die ihre Verwendung im Haushalt verhindern.Obwohl Generatoren auf chemischer Basis dafür ausgelegt sind, die gewünschte NO-Konzentration durch die Reduktion von NO2 zu liefern, das durch Distickstofftetroxid (N2O4) erzeugt wird [18], sind diese Geräte aufgrund der Toxizität von N2O4 immer noch nicht für die Heimtherapie geeignet.Daher hat sich die elektrochemische Erzeugung von NO aus einer Verbindungslösung als vielversprechendes Design mit höherer NO-Produktionskapazität, geringerer Produktion toxischer Nebenprodukte und niedrigeren Kosten herausgestellt.In dieser Studie schlugen wir ein neuartiges Design für einen tragbaren, erschwinglichen und praktischen NO-Generator (Electrochemical NO Generator, ENG) vor, der auf der Elektrolyse einer Nitrit/Cu(II)-Komplexlösung zur Erzeugung von gasförmigem NO basiert, und dessen Sicherheit und Wirksamkeit waren unter Verwendung von Schweinemodellen von PAH untersucht.Dieses Modell wird unter Verwendung von Bama-Miniaturschweinen erstellt, da seine physiologischen Merkmale des Pulmonalarteriendrucks und der vaskulären Widerstandsreduktionsmuster denen beim Menschen ähnlich sind.Das Ziel dieser Studie war die Entwicklung eines tragbaren und hochintegrierten NO-Generators, der in der Lage ist, NO durch elektrochemische Reduktion einer kostengünstigen Nitrit/Cu(II)-Ligandenlösung schnell, stabil und sicher zu erzeugen.Wir haben die Maschine außerdem mit dem Beatmungsgerät verbunden, um die Echtzeitkonzentration von NO und NO2 in der Pipeline zu überwachen und ihre Wirksamkeit für die Inhalationstherapie für PAH in einem Schweinemodell zu validieren.Für das durch Monocrotalin (MCT) induzierte PAH-Modell wurden Ferkel randomisiert den MCT- oder Vehikelgruppen zugeteilt.In der Studie zur NO-Behandlung wurden die Tiere willkürlich verschiedenen Gruppen zugeteilt.Die Stichprobengröße in Tierversuchen wurde auf der Grundlage früherer Studienberichte und unserer bisherigen Erfahrungen mit diesem Tiermodell bestimmt.Alle In-vivo-Experimente wurden dreimal durchgeführt.Bei histopathologischen Analysen wurden Verblindungsansätze verwendet.Die Experimentatoren waren gegenüber der Identität der Studiengruppen nicht blind.Die Tierstudie entspricht den Grundsätzen der ARRIVE-Leitlinien [19].Im ersten Modus enthielten stickstofferzeugende Membranmaterialien in der Stickstoff(N2)-Produktionseinheit eine oder mindestens zwei Kombinationen aus Poly(4-methyl-1-penten), bromiertem Polycarbonat, Polypropylen, Polyimid und Polydimethylsiloxan.Die durchschnittliche Porengröße des Stickstofffilms betrug 0,005–0,02 μm.Der Stickstofffluss wurde durch einen Massendurchflussregler auf 0,2–0,5 l/min geregelt.Zu der Lösung, die 0,5 M HEPES-Puffer (pH 7,3) und 1 M NaNO2 enthielt, wurden 7 mM Kupfersulfat und 7 mM Me3TACN als Ausgangsmaterialien für die elektrochemische Erzeugung von NO hinzugefügt und zu einem externen Elektrolysemodul zusammengebaut.Als Arbeitselektrode wurde ein 5 x 10 cm großes Au-Netz verwendet, das vollständig in die Lösung eingetaucht war.Das ausgespülte und gefilterte NO wurde in einem Tank mit gasförmigem N2 gespeichert, um die Umwandlung von NO in Stickoxide zu verhindern.NO wurde durch einen Massendurchflussregler in den NO 2 -Wäscher freigesetzt, der einen mit Ascorbinsäure beschichteten Träger umfasst.Der zweite Modus wurde durch das Umschaltventil eingestellt, in dem die Nitrit/Cu(II)-Komplexlösung zusammen mit dem restlichen NO unter Verwendung einer Mikroflüssigkeitspumpe kontinuierlich durch einen Gasextraktions-Silikonfaserdialysator zirkuliert wurde.Das restliche wässrige NO wurde aufgrund seiner hohen Permeabilität durch die Silikonfaserwand abgeschieden und durch das Trägergas in das NOx-Absorptionsmittel weggeschwemmt.Die Konzentration von NO/NO2/O2 wurde durch einen in den NO-Generator integrierten Chemilumineszenz-Gassensor (Honeywell, USA) überwacht und direkt auf dem Bedienfeld angezeigt.Gemäß den Echtzeit-Überwachungsdaten kann die NO-Konzentration jederzeit durch Betätigen des Knopfes auf das therapeutische Niveau eingestellt werden.Gemäß der internationalen Standardorganisation (ISO) 18562-3:2017 haben wir einen Gaschromatographen verwendet, um den Gehalt an flüchtigen organischen Verbindungen (VOCs) bei 25 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 40–60 % zu messen [20].Luftströmungsproben wurden 100 min beim ersten Lauf, 24 h nach der Arbeit und 7 Tage nach der Arbeit entnommen.Innerhalb von 100 min wurden für jede VOC-Messprobe insgesamt 10 l Gas gesammelt, um die Nachweisgrenze von 2 μg/m3 zu erreichen.Andere VOCs werden nach dem Verhältnis von Peakfläche zu Toluolfläche quantifiziert.Der ENG ist als Medizinprodukt für die Langzeitanwendung klassifiziert.Basierend auf dem von der ISO empfohlenen Schwellenwert für toxikologische Bedenken haben wir die kumulativen eingeatmeten VOCs unter Verwendung von ENG in täglichen Atemvolumen für Erwachsene (20 m3/Tag), Kinder (5 m3/Tag), Säuglinge (2 m3/Tag) und Neugeborene berechnet (0,21 m3/Tag) [21].Gemäß ISO 18562-2:2017 wurde ein Laser-Luftpartikelzähler verwendet, um bestimmte Stoffe unter Standardbedingungen zu messen [22].Wir haben die Probenahmezeit auf 24 h eingestellt, die Partikelzahlen von 0,3 μm, 0,5 μm, 1,0 μm, 2,5 μm, 5,0 μm und 10 μm aufgezeichnet und dann in Partikelgewichte pro Volumeneinheit (μg/m3) umgerechnet (V=4 /3*πR3, c=PVw/L *10−6, R=Radius, V= Volumen einer einzelnen Partikelgröße, p=maximale Dichte des Probenmaterials, w=Anzahl der Partikel, L=Gasvolumen, c= Partikelgewichte pro Volumeneinheit).Vor der Durchführung des Experiments nummerierten wir die Tiere in Spalte A und gruppierten die Tiere dann über eine computergenerierte Zufallszahlenmethode (Microsoft Excel).Zweitens haben wir die Funktion RAND() verwendet, um 16 verschiedene Zufallszahlen (zwischen 0 und 1) in Spalte B zu generieren. Dann haben wir die Funktion RANK(B1, B:B) verwendet, um 16 verschiedene Zufallszahlen (zwischen 1 und 16) in Spalte zu generieren C. Schließlich haben wir alle fortlaufenden 6 Nummern der Spalte C von oben nach unten geordnet in die 3 bestimmten Studiengruppen eingeteilt.Insgesamt achtzehn 3 Monate alte gesunde weibliche Bama-Miniaturschweine (von Wujiang Tianyu Biotechnology Co., LTD) (mittleres Gewicht 7,3 ± 0,4 kg) wurden zufällig in die Kontrollgruppe (n = 6), die PAH-Gruppe (n =6) und PAH+NO-Gruppe (n=6).Die Tiere wurden separat in einem Edelstahlkäfig aufgezogen und mit qualifiziertem Futter und Trinkwasser versorgt.Die Temperatur und Feuchtigkeit des Tierstalls wurden überwacht, und die Licht- und Dunkelzyklen wurden für 12 h abgewechselt.Ferkeln in der PAH/PAH+NO-Gruppe wurde MCT (12 mg/kg, gelöst in 75 % Alkohol) zweimal im Abstand von 1 Woche intraperitoneal injiziert, und die Kontrollgruppe erhielt 75 % Alkohol.Das Tiermodell war 6 Wochen nach der ersten Dosis für das Experiment bereit (präoperatives mittleres Gewicht, 14,2 ± 1,2 kg).Für das MCT-induzierte PAH-Modell wurden Ferkel ausgeschlossen, wenn der mittlere PAP < 20 mmHg war.Während des gesamten Experiments wurden Ferkel ausgeschlossen, wenn sie während der Operation starben.Zu den präoperativen Vorbereitungen gehörten die intramuskuläre Verabreichung von Atropin (0,02–0,04 mg/kg) zur Hemmung der Drüsensekretion, Zoletil 50 (5 mg/kg) zur Narkoseeinleitung, Enrofloxacin (5 mg/kg) zur Vorbeugung von Infektionen und Meloxicam (0,2 mg/kg). ) zur Analgesie.Die Anästhesie wurde mit 1,5–3 % inhaliertem Isofluran in 50 % O2 über eine Maske, die mit einem Beatmungsgerät und ENG verbunden war, aufrechterhalten.Die PAH+NO-Gruppe erhielt zunächst 4 h lang eine Inhalation von NO (20 ppm), und die Konzentration wurde dann alle 30 min um 5 ppm verringert, bis sie schließlich 1 ppm erreichte und 30 min lang beibehalten wurde.Die Hämodynamik wurde bei anästhesierten Tieren mit einem 5F-Swan-Ganz-Katheter gemessen, und die Signale wurden von einem physiologischen Mehrkanal-Signalerfassungs- und -verarbeitungssystem (RM6240E/EC, Chengdu Instrument Factory, China) bei 0 h, 0,5 h, 2 h, 6 erfasst h und 12 h nach der Operation.Die Herzleistungsindikatoren wurden durch Thermodilution bestimmt, was dem Mittelwert von drei Messungen nach schneller intravenöser Verabreichung von 10 ml kalter Kochsalzlösung entspricht.Der pulmonale Gefäßwiderstand (PVR), der pulmonale Gefäßwiderstandsindex (PVRI), das Herzzeitvolumen (CO) und der Herzzeitvolumenindex (CI) wurden mit Standardformeln berechnet.Zusätzlich wurden arterielle Blutgase (ABL90, RADIOMETER, Dänemark), routinemäßige Blutparameter, biochemische Parameter, Gerinnungsfaktoren und Methämoglobinkonzentrationen zu den entsprechenden Zeitpunkten bestimmt.Die Tiere wurden am geplanten Autopsietag (12 Stunden nach der Operation) durch intravenöse Injektion von Pentobarbital-Natrium in einer Dosis von 100 mg/kg eingeschläfert, gefolgt von anatomischer und histopathologischer Untersuchung.Die rechte Ventrikelwand und das Lungengewebe wurden am Ende des Experiments geerntet.Für jede experimentelle Gruppe werden alle Datenpunkte in die Analyse einbezogen.Die geernteten Gewebe wurden über Nacht in 4 % Paraformaldehyd fixiert.Myokard- und Lungengewebe wurden in Paraffin eingebettet und bei 5 μm geschnitten.Dann wurden die Schnitte mit H&E, Verhoeff Van Gieson (EVG) und Masson unter Verwendung von im Handel erhältlichen Kits (Leagene) gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt.Die histologischen Veränderungen wurden mit einem Lichtmikroskop (Leica) beobachtet.Die Immunfluoreszenz wurde nach einem Standardprotokoll durchgeführt.Kurz gesagt wurden Lungengewebe in 4 % Paraformaldehyd fixiert.Nach Hydratation mit Gradientenalkohol wurde Citrat (pH = 6,5) zur Antigenreparatur von Lungenschnitten verwendet.Danach wurden die Schnitte mit 5 % Ziegenserum für 2 h geblockt und dann mit Primärantikörper (Kaninchen-anti-Ki67, 1:200, Nr. 27309-1-AP, Proteintech; Kaninchen-anti-α-SMA, 1:200) inkubiert , Nr. ab5694, Abcam) bei 4°C über Nacht.Die Schnitte wurden dann mit Fluorochrom-konjugierten sekundären Antikörpern für 60 min bei Raumtemperatur gefärbt.Die Bilder wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (SP8; Leica) aufgenommen.Gesamtprotein wurde unter Verwendung von RIPA-Puffer mit Protease-Inhibitoren (Roche) extrahiert.Für die Immunoblot-Analyse wurden Proteinproben durch SDS-PAGE aufgelöst und mit einem iBlot 2-Trockenblotsystem (Thermo Fisher Scientific) auf Nitrozellulosemembranen übertragen.Die Membranen wurden in 5 % fettfreier Trockenmilch in TBST (100 mmol/l Tris, pH 7,5, 0,9 % NaCl, 0,1 % Tween-20) für 1 Stunde blockiert und mit primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C (Kaninchen-anti-eNOS, 1:1000, Nr. ab5589, Abcam, Kaninchen-anti-beta-Aktin, 1:1000, Nr. 20536-1-AP, Proteintech, Kaninchen-anti-PKG, 1:500, Nr. bs-6705R, Bioss, Kaninchen-anti-sGC , 1:500, Nr. bs-13544R, Bioss).Die Membranen wurden mit TBST gewaschen und für 1 h mit Ziegen-anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper (1:8000, ZSGB-Bio) bei Raumtemperatur inkubiert.Die Blots wurden unter Verwendung von ECL (Thermo Fisher Scientific) entwickelt, und Bilder wurden mit einem Lumineszenzbildanalysator (GE) aufgenommen.Alle Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt.Die Normalverteilung wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test getestet.Der Student-t-Test wurde verwendet, um die Mittelwerte zweier unabhängiger Gruppen zu vergleichen, und eine Zweiweg-ANOVA mit wiederholten Messungen wurde verwendet, um die Wirkung des Einatmens von elektrochemisch erzeugtem NO auf PAP und PVR zu bestimmen (GraphPad Prism 7.0; GraphPad Software Inc.).P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.Um den Anforderungen der NO-Inhalationstherapie zu Hause bei Patienten mit PAH gerecht zu werden, haben wir einen steuerbaren NO-Generator entwickelt, der auf der elektrochemischen Reduktion von Nitrit basiert.In dieser neuartigen Vorrichtung werden erhebliche Mengen an NO elektrochemisch auf der Oberfläche einer Au-Netzelektrode durch Reduktion einer Nitritlösung in Gegenwart von Kupfer(II)1,4,7-trimethyl-1,4,7-triazacyclononan ( Cu(II)Me3TACN) ohne toxische Nebenprodukte zu produzieren.Der ENG kann mit nur einem Knopf schnell hochreines NO erzeugen, was den Betrieb am Krankenbett oder zu Hause ermöglicht.Um den mobilen Einsatz zu ermöglichen, war der NO-Generator sehr klein gebaut (41,2 cm × 38,5 cm × 19,8 cm) und wog insgesamt nur 15 kg.Dieses Gerät ist einfach mit einem einzigen Knopf zu bedienen, und die Echtzeit-Gaskonzentrationen von NO, NO2 und O2 werden auf einer benutzerfreundlichen Oberfläche angezeigt (Abb. 1A).Design, Konfiguration und Schema eines neuartigen ENG-Modells.A Aussehen, Größe und Konfiguration des ENG.B Detaillierte Positionierung jeder Einheit innerhalb des hochintegrierten NO-Generators.C Schematische Darstellung des ENG, der aus 4 hintereinander geschalteten Einheiten und zwei Arbeitsmodi besteht, die von einem Umschaltventil gesteuert werden.Der NO-Generator wurde an die Ventilatorleitung angeschlossen und von der Platine überwachtDie hochintegrierte ENG besteht aus einer Stickstofferzeugungseinheit, einer NO-Erzeugungseinheit, einer Reinigungseinheit und einer Ausgabeeinheit (Abb. 1B).Die Stickstofferzeugungseinheit befindet sich unten und enthält eine Stickstofferzeugungseinrichtung und eine Filtereinrichtung.Die Druckluft wird durch eine Filtervorrichtung gefiltert, um sicherzustellen, dass der Staub, die Partikel oder das Aerosol keinen Einfluss auf die ENG haben, und dann tritt die Luft in die Stickstofferzeugungsvorrichtung ein, wo Sauerstoff (O2) und Stickstoff (N2) werden durch ihre unterschiedlichen Permeationsraten durch die Hohlfasermembran getrennt.Die NO-Erzeugungseinheit befindet sich neben der Stickstofferzeugungseinheit und enthält ein externes Elektrolysemodul mit einem kreisförmigen Anschluss und einer eingebauten Gasaustauschfaser.Das Elektrolysemodul ist ein Verschleißteil, das leicht auszutauschen ist und die Kapazität hat, NO mit einem Volumen zu erzeugen, das dem von fünf 8-l-NO-Zylindern entspricht.Die Gasaustauschfaser ist dafür verantwortlich, restliches NO aus dem Elektrolyten zu entfernen.Eine Reinigungseinheit, bestehend aus einem Salzfilterfilm, einem Nafionfilm und einem Reinigungsfilter, befindet sich zwischen der NO-Erzeugungs- und Ausgabeeinheit, um Salznebel, Feuchtigkeit und alle Verunreinigungen zu beseitigen, die den Patienten schaden könnten.Die Ausgabeeinheit befindet sich oben und umfasst einen NO-Speichertank und einen mit Ascorbinsäure beschichteten NO2-Wäscher zur Reduktion von NO2 zu NO.Der ENG kann in zwei Modi arbeiten (Fig. 1C).Der erste Modus dient der schnellen Produktion von High-Flow-NO, das mit einem Fritte-Gassprudler erzeugt wird.In diesem Modus wird die Luft komprimiert und in die Stickstofferzeugungseinheit gefiltert, um ≥99,0 % N2 zu erreichen, das durch eine Spülung in die Elektrolysezelle gesprüht wird, um das im Elektrolysetank erzeugte NO zu entfernen.Das gereinigte NO wird im Lagertank zu einem bestimmten Anteil mit N2 vermischt und das restliche NO2 im NO2-Wäscher zu NO reduziert.Dann ist NO für die medizinische Verwendung leicht verfügbar.Der ENG kann zur direkten Inhalation an eine Maske oder an den Ausgang des Beatmungsgeräts angeschlossen werden, das von einem Mikrocontroller überwacht und geregelt wird.Im zweiten Modus wird die Elektrolytlösung aus der Elektrolysezelle geleitet und fließt durch ein Rückflussrohr, das mit einer Siliziumfasermembran ausgekleidet ist, währenddessen restliches NO in das NOx-Absorptionsmittel extrahiert wird.Dieser Extraktionsprozess wird durch Umschalten des Ventils eingeleitet und verhindert eine chemische Erosion der Elektrode durch Rest-NO in der Lösung, wenn die NO-Freisetzung beendet ist.Insgesamt wurde unser neuartiges NO-Generatormodell entwickelt, um NO in einem kompakten und tragbaren Gerät zu synthetisieren, zu reinigen, zu recyceln und freizusetzen.Aufgrund seiner geringen Größe und des bequemen Austauschs von Verbrauchsmaterialien hat dieses Gerät ein großes Potenzial für den Einsatz in verschiedenen klinischen Umgebungen, einschließlich der Behandlung im Krankenhaus und der Verwendung zu Hause für Patienten mit PAH.Als nächstes testeten wir die Effizienz der NO-Produktion, indem wir aufeinanderfolgende Ströme von 10 bis 90 mA an die Elektroden im ENG anlegten.Es wurde ein breiter Bereich von NO-Konzentrationen von 390 ppm bis 3500 ppm erzeugt, und die Umschaltzeit der NO-Produktion betrug weniger als 5 min (Abb. 2A).Wichtig ist, dass der NO-Spiegel mit zunehmendem Strom, der an die Elektroden angelegt wird, linear zunimmt, was eine theoretische Grundlage für die anhaltende und präzise Freisetzung von NO bietet (Abb. 2B).Um die tatsächliche Gasproduktionseffizienz zu verstehen, haben wir die Faraday-Effizienz getestet.Bei 40 mA Strom beträgt die Faraday-Effizienz etwa 74 %.Der Wert nimmt mit höherem Strom ab und variiert zwischen 61~74%.Darüber hinaus konnte die Elektrolysezelle für fünf aufeinanderfolgende Zeiträume einen konstanten NO-Pegel erzeugen (Abb. 2C), was auf ihre hervorragende Zuverlässigkeit für die präzise Steuerung der NO-Produktion bei einer festen Konzentration hinweist.Um die Erzeugungsrate und Sicherheit des freigesetzten NO zu bestätigen, überwachten wir NO und NO2 gleichzeitig am Ende der Pipeline.Die Ergebnisse zeigten, dass ENG die gewünschte NO-Dosis innerhalb von 2 Minuten erreichen konnte und NO2 unabhängig von der therapeutischen NO-Dosis in einer extrem niedrigen Konzentration (< 1 ppm) vorlag (Abb. 2D).Darüber hinaus blieb NO2 auch unter einem breiteren Bereich von erzeugtem NO auf extrem niedrigen Niveaus (Zusatzdatei 1: Tabelle S1, Abbildung S1).Gemäß ISO 18562:2017 Biokompatibilitätsbewertung von Atemgaswegen in Gesundheitsanwendungen haben wir die Emission von VOCs und Partikeln am Ende der Pipeline weiter getestet.Die Ergebnisse zeigten, dass die VOCs für die Patienten unterschiedlichen Alters unterhalb der Schwelle toxikologischer Bedenken lagen (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S2-S5).Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Partikel weniger als 10 μg/m3 betrugen, was ebenfalls im Sicherheitsbereich liegt (Zusatzdatei 1: Tabelle S6).NO-Produktion und NO2-Überwachung mit dem ENG.Eine Überwachung der NO-Konzentration in der Lösung mit unterschiedlichen angelegten Stromstärken.B Die lineare Beziehung zwischen der kalibrierten NO-Konzentration und den angelegten Strömen.C NO -Niveaus, die für fünf aufeinanderfolgende Zeiträume erzeugt wurden.DNO2-Spiegel unter therapeutischen NO-DosenZusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass unser ENG eine hervorragende Kapazität für eine effiziente, nachhaltige und stabile NO-Produktion mit einem großen Einstellbereich und minimaler Nebenproduktproduktion hat.Um die Wirksamkeit des ENG zur Behandlung von PAH zu untersuchen, etablierten wir ein Schweinemodell durch zweimalige intraperitoneale Injektion von 12 mg/kg MCT (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S7 und Tabelle S8).Die elastische EVG-Färbung des Lungengewebes in der MCT-Gruppe zeigte eine ungleichmäßige Verdickung der mittleren Schicht der Pulmonalarterien, begleitet von Lumenstenose (schwarzer Pfeil), viel stärker muskulaturisierten kleinen Pulmonalarteriolen (schwarze Pfeile) und pulmonaler interstitieller Hyperplasie mit entzündlicher Zellinfiltration (Abb. 3A).Ki67 (P < 0,01, n = 3) und α-SMA (P < 0,01, n = 3) Immunfluoreszenzfärbung von Lungengewebe zeigten eine signifikant erhöhte Gefäßwandproliferation und Verdickung der Lungenarteriolen in der MCT-Gruppe im Vergleich zur Vehikelgruppe ( Abb. 3B).Die H&E-Färbung des rechten Ventrikels zeigte deutliche Ödeme und Störungen der Kardiomyozyten in der MCT-Gruppe, und die Masson-Färbung zeigte eine höhere Belastung durch myokardiale Fibrose in der MCT-Gruppe (P < 0,01, n = 3) (Abb. 3C).Darüber hinaus zeigte die MCT-Gruppe auch eine stark verdickte Tunica media in der Hauptpulmonalarterie (P < 0,05, n = 3) (Abb. 3D).Darüber hinaus zeigte Western Blotting, dass die Spiegel der endothelialen Stickoxidsynthase (eNOS) in der MCT-Gruppe im Vergleich zur Vehikelgruppe signifikant erniedrigt waren, was darauf hindeutet, dass die endotheliale Synthese von endogenem NO bei PAH abgeschwächt war (P < 0,01, n = 3) (Abb 3E).Aus hämodynamischer Sicht höhere sPAP (P=0,002, F=1,637, df=10, n=6), dPAP (P=0,027, F=2,384, df=10, n=6), mPAP (P=0,004, F=0,509, df=10, n=6), PVR (P=0,001, F=3,66, df=10, n=6) und PVRI (P=0,001, F=2,656, df=10, n=6). ) und unterem Schlagvolumen (SV) (P=0,001, F=2,932, df=10, n=6), CO (P=0,001, F=0,097, df=10, n=6) und CI (P= 0,001, F = 6,585, df = 10, n = 6) wurden in der MCT-Gruppe beobachtet als in der Vehikelgruppe (Abb. 3F).Diese Ergebnisse legen nahe, dass das MCT-induzierte PAH-Schweinemodell erfolgreich etabliert wurde und zur Bewertung der therapeutischen Wirkung der ENG verwendet werden könnte.Etablierung eines Schweine-PAH-Modells.Eine elastische EVG-Färbung der Lunge zeigt die pathologischen Veränderungen bei Ferkeln mit MCT-induzierter PAH und der Vehikel-behandelten Gruppe.Die Pfeile zeigen eine ungleichmäßige Verdickung der mittleren Schicht der Pulmonalarterien mit Lumenstenose, muskulöser Pulmonalarteriolen und interstitieller Verdickung der Lunge mit entzündlicher Zellinfiltration.B Immunfluoreszenzfärbung von Ki67 und α-SMA in Paraffin-eingebetteten Schnitten von Lungengewebe von Ferkeln mit MCT-induzierter PAH oder der mit Vehikel behandelten Gruppe.Maßstabsbalken, 50 μm.C H&E-Färbung und Masson-Färbung des rechtsventrikulären Myokards von Ferkeln mit MCT-induzierter PAH oder der mit Vehikel behandelten Gruppe.Maßstabsbalken, 50 μm für die H&E-Färbung und 100 μm für die Masson-Färbung.D EVG-Färbung der Tunica media der Hauptpulmonalarterie von Ferkeln mit MCT-induzierter PAH oder der mit Vehikel behandelten Gruppe.Maßstabsleisten, 2 mm.E Repräsentative Bilder und Quantifizierung der eNOS-Expression im Lungengewebe von Ferkeln mit MCT-induzierter PAH oder der Vehikel-behandelten Gruppe durch Western Blotting.F Hämodynamische Daten für den Lungenkreislauf, einschließlich sPAP, dPAP, mPAP, SV, CO, CI, PVR und PVRI, wurden durch Katheterintervention bei Ferkeln mit MCT-induzierter PAH oder der Vehikel-behandelten Gruppe gemessen und berechnet.* P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001;verglichen mit der Vehikelgruppe, wie durch Student's t-Test analysiertDurch die Verwendung eines Schweinemodells von PAH untersuchten wir weiter, ob die ENG PAP reduzieren könnte.Wir schlossen die ENG an ein Beatmungsgerät an und zeichneten die Veränderungen des PAP mit einem Swan-Ganz-Katheter vor und nach der NO-Inhalation auf (Abb. 4A).In der PAH+NO-Gruppe inhalierten die Tiere 4 h lang NO mit 20 ppm als Anfangsdosis, und die NO-Konzentration nahm in den folgenden 2 h mit einer Geschwindigkeit von 10 ppm pro Stunde ab.Nach NO-Inhalation war die Expression von löslicher Guanylatcyclase (sGC) (P < 0,05, n = 3) und PKG (P < 0,05, n = 3) signifikant erhöht, was darauf hindeutet, dass inhaliertes NO den cGMP-vermittelten Signalweg aktiviert (Abb 4B).Wie erwartet zeigte die arterielle Blutgasanalyse, dass die PaO2-Anreicherung im Vergleich zu 0,5 h (p < 0,001), 2 h (p < 0,001) und 6 h (p < 0,01) nach der NO-Inhalation signifikant erhöht war (Abb. 4C und zusätzliche Datei 1: Tabelle S9).Im Vergleich zur PAH-Gruppe zeigte die PAH+NO-Gruppe signifikant niedrigere Werte von sPAP (p = 0,045 nach 0,5 h, p = 0,032 nach 2 h), dPAP (p = 0,05 nach 0,5 h, p = 0,030 nach 2 h) und mPAP ( P = 0,036 bei 0,5 h, P = 0,006 bei 2 h) nach der Inhalation (Abb. 4D), begleitet von konsistenten Verbesserungen bei SV (P = 0,007 bei 0,5 h, P = 0,003 bei 2 h), CO (P = 0,005 bei 0,5 h, P = 0,013 um 2 h) und CI (P = 0,026 um 0,5 h, P = 0,014 um 2 h) (Abb. 4E).Darüber hinaus waren der berechnete PVR (P=0,001 nach 0,5 h, P=0,001 nach 2 h) und der PVRI (P=0,007 nach 0,5 h, P=0,001 nach 2 h) zum gleichen Zeitpunkt in der PAH+NO-Gruppe gelindert ( Abb. 4F).Die ENG linderte effektiv die Hypoxämie und verbesserte die pulmonale Hämodynamik im Schweine-PAH-Modell.AA-Schema der Verbindung des ENG mit dem Beatmungsgerät und der Erfassung hämodynamischer Daten.B Western Blot für sGC und PKG im Lungengewebe von Ferkeln mit PAH mit oder ohne NO-Inhalation (n=6/Gruppe).C PaO2-Nachweis bei Ferkeln mit PAH mit oder ohne NO-Inhalation oder der Scheingruppe zum angegebenen Zeitpunkt (n=6/Gruppe).D–F Die Messung von PAP (D);SV, CO und CI (E);und PVR und PVRI (F).* P < 0,05, ** P < 0,01;im Vergleich zur PAH-Gruppe, analysiert durch Student's t-Test (B) oder Zweiweg-ANOVA mit wiederholten Messungen (C–F)Bluttests, Serumbiochemie und Gerinnungsuntersuchungen zeigten keine signifikanten Unterschiede (P > 0,05) vor und nach der Anwendung des ENG (Abb. 5A–C, zusätzliche Datei 1: Tabelle S10), was auf eine minimale Hepatotoxizität und hämatologische Toxizität hindeutet.Nach der ENG-Behandlung blieb das Methämoglobin in der PAH+NO-Gruppe auf einem normalen Niveau und stieg im Vergleich zu dem in der PAH-Gruppe (P > 0,05) (Fig. 5D) nicht signifikant an, was darauf hinweist, dass die therapeutische Konzentration von NO, das durch die produziert wird ENG verursachte keine Methämoglobinämie.In der Pathologie verursachte die ENG keine signifikanten Verletzungen der Lungenbronchiolen und terminalen Bronchien bei PAH-Ferkeln (Fig. 5E).Untersuchung physiologischer Indikatoren und Lungenpathologie nach NO-Inhalation mit dem ENG.A–D Vergleich von Blutzellen (A);Leber- und Nierenfunktion (B);prokoagulatorische Funktion (C);und Methämoglobin (D) zwischen Ferkeln mit PAH, die mit ENG behandelt wurden, und solchen, die nicht mit ENG behandelt wurden;verglichen mit der PAH-Gruppe, wie durch Student's t-Test analysiert.E H&E-Färbung von Paraffinschnitten von Bronchiolen (Maßstabsbalken, 500 μm) und terminalen Bronchien (Maßstabsbalken, 50 μm)Zusammen haben wir in einem Schweine-PAH-Modell bestätigt, dass die ENG die hämodynamische Beeinträchtigung wirksam lindern und die Herzfunktionen bei einem therapeutischen Niveau des abgegebenen NO verbessern kann, ohne hämatologische Störungen, hepatische Störungen und Lungenverletzungen zu verursachen.Derzeit gibt es mehrere Designs von NO-Generatoren für die Inhalationstherapie, aber keines ist für den Heimgebrauch bei der Behandlung von PAH verfügbar [14].Hier haben wir ein neuartiges Modell eines NO-Generators entworfen, der gasförmiges NO aus einer Nitritlösung über ein elektrochemisches Verfahren ableitet, und seine Wirksamkeit und Sicherheit in einem präklinischen Modell verifiziert.Der ENG lieferte NO in einem therapeutischen Bereich von 0–100 ppm in 5 min mit vernachlässigbaren NO2-Werten (<1 ppm) und erfüllte die vom National Institute for Occupational Safety and Health [23] festgelegten Qualitäts- und Sicherheitsanforderungen.Das elektrolytische Schlüsselmodul im ENG konnte mindestens 7 Tage lang eine konstante NO-Ausgabe von 20 ppm aufrechterhalten, und das Modul konnte einfach und kostengünstig ersetzt werden.Bei Ferkeln mit MCT-induzierter PAH verbesserte unser Gerät effektiv Hämodynamik und Herzfunktionen, ohne größere physiologische Störungen zu verursachen.Gegenwärtige Medikamente, die zur Behandlung von PAH verwendet werden, ob intravenös, subkutan oder oral verabreicht, sind in unterschiedlichem Ausmaß mit einer dosisabhängigen systemischen Hypotonie verbunden.Bemerkenswerterweise fehlt diese Nebenwirkung bei inhalativen Medikamenten, einschließlich Iloprost und NO.Iloprost wird im Allgemeinen alle 2–8 h mit intermittierenden therapeutischen Wirkungen verabreicht, wohingegen NO relativ lange inhaliert werden kann und stabile therapeutische Wirkungen beibehält.Für die Anwendung der NO-Inhalationstherapie zu Hause könnte eine kontinuierliche niedrig dosierte Inhalation während der Schlafenszeit eine praktikable Option sein, ohne den Ruhezustand des Patienten zu beeinträchtigen.Um dieses Ziel zu erreichen, wird dringend ein zuverlässiger NO-Generator für den Heimgebrauch benötigt.Unser Gerät enthält mehrere wichtige technische Innovationen, um dieses Ziel zu erreichen.Erstens verwendet der ENG N2 als Spülgas, um die Reaktion zwischen O2 und dem neu gebildeten NO zu eliminieren und um zu verhindern, dass der Kupfer(II)-Ligand-Katalysator in der Lösung in der Nähe der Elektroden oxidiert.Als Ergebnis stieg die Effizienz der NO-Erzeugung mit einem höheren N2-Spülfluss.Im Speichertank werden das erzeugte NO und N2 unter Druck gesetzt, um die Disproportionierung von NO zu minimieren, und ermöglichten auch eine stabile und einstellbare Ausgabe von hochreinem NO bei unterschiedlichen Durchflussraten des Ventilators.Wir stellen die Flussrate derzeit zwischen 0,3 und 0,5 l/min ein, was ausreicht, um die Anforderungen der meisten klinischen Umgebungen zu erfüllen.Zweitens wurde eine Kombination aus einer inerten Elektrode (Au) und einer Cu-haltigen Elektrolytlösung zur NO-Erzeugung verwendet.